Melakukan Sekuensing DNA Sendiri di Rumah

 (bradleywoolf.com)
1 poin oleh GN⁺ 4 jam lalu | 1 komentar | Bagikan ke WhatsApp
  • Bagi orang yang ingin mencoba sekuensing genom dengan perangkat pribadi, prosedur homelab nyata dan peralatan yang diperlukan disusun dalam satu alur, mulai dari pengambilan sel pipi hingga analisis VCF
  • Sel dari bagian dalam pipi yang digunakan sebagai sampel eksperimen mudah diperoleh, tetapi tidak cocok untuk pertanyaan yang membutuhkan konteks jaringan, seperti diagnosis kanker atau analisis inflamasi maupun ekspresi gen pada jaringan tertentu
  • Nilai data genom bukan terutama untuk mendapatkan diagnosis langsung, melainkan untuk menjadikan VCF sebagai lapisan referensi yang dapat dikueri, lalu mengeksplorasi varian dengan VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude, dan lainnya
  • Persiapannya memakan waktu sekitar dua bulan, dan MinION saja sekitar US$7.500, sehingga jika memperhitungkan perangkat, reagen, bahan habis pakai, dan lingkungan analisis, hambatan biayanya masih besar bagi rata-rata individu
  • Eksekusi dengan input rendah dan coverage rendah harus dipandang sebagai validasi teknis, bukan interpretasi tingkat medis; penting untuk tidak menafsirkan varian dengan coverage rendah secara berlebihan

Cakupan dan batasan sekuensing DNA di rumah

  • Berdasarkan pengalaman melakukan sekuensing genom sendiri sebanyak 5 kali dengan Oxford Nanopore Technologies MinION
    • Mengambil sel dari bagian dalam pipi dengan cotton swab
    • Menyiapkannya sebagai sampel untuk sekuensing
    • Memuatnya ke sequencer
    • Menganalisis data hasilnya
  • Sel pipi mudah diperoleh dan cepat tergantikan, tetapi tidak cocok untuk semua pertanyaan biologis
    • Tidak digunakan untuk diagnosis kanker
    • Tidak cocok untuk diagnosis inflamasi atau untuk memeriksa gen yang aktif di bagian tubuh lain
    • Untuk melihat gen yang diekspresikan pada sel inflamasi di area biduran di dada, perlu membandingkan sel yang bermasalah dengan sel normal
  • Seluruh persiapan memakan waktu sekitar dua bulan, dan biayanya masih berada pada level yang sulit dijangkau rata-rata individu
    • Biayanya sedang turun
    • Dalam jangka panjang, teknologi yang dapat memberi tahu ekspresi DNA dan RNA secara real-time seperti ponsel atau AI dipandang akan menjadi mungkin

Hal yang bisa dilakukan dengan data genom

  • Genom bukan “sihir”, melainkan lapisan referensi; jika memiliki VCF, kita dapat menguerinya dengan berbagai alat
  • Alat yang dapat digunakan antara lain VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude, dan lainnya
  • Berdasarkan VCF, pertanyaan berikut dapat dieksplorasi
    • Varian apa yang dimiliki
    • Gen dan pathway apa yang terdampak
    • Obat apa yang mungkin dimetabolisme secara berbeda
    • Varian langka apa yang perlu diperhatikan secara serius
    • Area mana yang belum diketahui model
  • Informasi yang dihasilkan belum berada pada level diagnosis
    • Ini juga bukan kesimpulan seperti “karena AI mengatakannya, edit diri sendiri dengan CRISPR”
    • Nilai terdekatnya ada pada mengubah genom statis menjadi bentuk yang dapat dikueri
  • DNA adalah referensi yang stabil, sementara RNA lebih dekat dengan kondisi saat ini; dalam jangka panjang, data biosensor dapat diintegrasikan ke dalam satu model pribadi

Peralatan dan bahan habis pakai yang diperlukan

  • Perangkat keras inti adalah Oxford Nanopore Technologies MinION, dengan harga US$7.500
    • Laptop atau workstation untuk menjalankan MinKNOW
    • Penyimpanan 100GB atau lebih untuk output
    • GPU untuk basecalling Dorado
    • Vortex, heat block, sentrifus
  • Bahan habis pakai utama mencakup ONT sequencing kit, flow cell wash kit, material kontrol, PBS, dan swab sel pipi
  • Reagen dibagi menjadi ekstraksi DNA, persiapan library, priming flow cell, dan pengukuran kuantitatif
  • Peralatan bench dan bahan habis pakai plastik juga diperlukan secara terpisah
    • microcentrifuge, magnetic rack, tube racks, ice bucket, -20°C freezer, 4°C fridge, pipettes
    • sterile cheek swabs, LoBind tubes, PCR tubes, Qubit assay tubes, filtered tips, wide-bore P200 tips, gloves

Alur eksperimen: dari pengambilan sampel hingga library akhir

  • Tujuan keseluruhan adalah mengubah 2 sampel swab pipi menjadi library yang dapat disekuensing dengan MinION
  • Tahap persiapan mencakup memakai sarung tangan, membersihkan bench, memberi label pada tube, menyeimbangkan AMPure XP beads ke suhu ruang, menjaga enzim tetap dingin, mengatur heat block ke 56°C, dan memeriksa reagen ONT
  • Pengambilan dan pemekatan sel dilakukan dengan menggosok bagian dalam pipi selama 60 detik, memasukkannya ke PBS, lalu memperoleh pellet kecil berwarna putih atau putih keabu-abuan melalui sentrifugasi
    • PBS dapat menjadi sedikit keruh
    • Penting untuk tidak menyedot pellet
  • Dengan Monarch kit, sel dilisis dan DNA diikat ke capture beads
    • Setelah lisis, prioritasnya adalah menjaga DNA berbobot molekul tinggi, jadi vortex tidak digunakan
    • Beads yang sudah terikat DNA tidak boleh hilang
    • Ethanol harus sudah ditambahkan ke gDNA Wash Buffer
  • Genomic DNA yang telah dimurnikan dikuantifikasi dengan Qubit
    • Menggunakan 1x dsDNA High Sensitivity
    • Jika konsentrasi sampel terlalu rendah, ukur ulang di tube Qubit baru dengan lebih banyak DNA
    • Jika hanya menambahkan DNA ke tube lama, perhitungan assay akan rusak
  • Titik jeda paling tepat adalah segera setelah ekstraksi DNA
    • Beri label dengan jelas pada DNA LoBind tube
    • Setelah quick spin, simpan di kulkas 4°C tanpa vortex

Persiapan library dan pemuatan flow cell

  • Input ideal untuk repair/end-prep adalah 1.000ng DNA dalam 47µL
    • Jika DNA terlalu encer sehingga 1.000ng tidak muat dalam 47µL, gunakan volume maksimum yang memungkinkan
    • Contoh eksekusi pertama dengan input rendah adalah 0,296ng/µL × 47µL, sekitar 13,9ng; jauh di bawah input yang direkomendasikan, tetapi berguna untuk latihan end-to-end
  • Untuk repair/end-prep digunakan FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix, dan N-Prep Enzyme Mix
    • Salt-T4 DNA Ligase tidak digunakan pada tahap ini, melainkan nanti
    • Jika tidak menggunakan DCS, optional 1µL DCS diganti dengan nuclease-free water
  • Setelah AMPure cleanup, adapter ligation dilakukan untuk memasang adaptor sekuensing ONT
    • Reaksi berisi repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase, dan LA
    • Jika LA dihilangkan, library yang dapat disekuensing tidak akan terbentuk
    • Jika Salt-T4 DNA Ligase dihilangkan, adapter ligation akan gagal
    • Jika LNB tidak dicampur dengan benar, chemistry ligation akan memburuk
    • Vortex dihindari karena dapat menyebabkan shearing DNA
  • Cleanup adapter-ligated library menggunakan LFB, bukan ethanol
    • Aturan praktisnya adalah “Liquid moves. Beads stay.”
    • Beads tidak dipindahkan ke library akhir
  • Library akhir juga dikuantifikasi ulang dengan Qubit
    • Eksekusi input rendah dapat menghasilkan nilai rendah atau gagal
    • Dalam eksekusi latihan, jangan menghabiskan library secara berulang di Qubit; loading mix dapat dilanjutkan dengan 12µL library

Eksekusi MinION dan pemrosesan data

  • Di MinKNOW, periksa flow cell dan catat active pores
    • Lebih dari 1200: bagus
    • 800–1200: dapat digunakan
    • 500–800: batas bawah atau untuk latihan
    • Kurang dari 500: buruk, tetapi latihan mekanis masih mungkin
    • Kurang dari 200: nyaris tidak bernilai selain untuk latihan loading
  • Ada tiga tube yang ditangani pada tahap akhir
    • Final library: DNA library setelah adapter cleanup
    • Priming mix: untuk menyiapkan flow cell
    • Loading mix: berisi final library, sequencing buffer, library beads
  • Port pada flow cell ada dua
    • Priming port: berada di bawah sliding cover dan diisi priming mix
    • SpotON sample port: sample well kecil, tempat loading mix dimasukkan tetes demi tetes
  • Final library tidak dimuat langsung ke flow cell, melainkan dimasukkan lebih dulu ke loading mix tube
  • Pengaturan dasar MinKNOW adalah sebagai berikut
    • Flow cell type: FLO-MIN114
    • Kit: SQK-LSK114
    • Basecalling: ON
    • Model: High-accuracy / HAC
    • Barcoding: OFF
    • Alignment: OFF
    • Adaptive sampling: OFF
    • Raw reads / POD5: ON
    • Filtering: OFF untuk eksekusi latihan input rendah
  • Pada eksekusi latihan input rendah, disarankan menyalakan raw POD5 agar tetap bisa dianalisis nanti, meskipun live output tidak bagus

Pipeline analisis

  • Jika perlu, lakukan basecalling dengan Dorado setelah eksekusi
    • dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam
    • Jika perlu, konversi ke FASTQ dengan samtools fastq calls.bam > reads.fastq
    • Untuk pemeriksaan awal cepat, HAC dapat digunakan sebagai pengganti SUP
  • Untuk human reference, gunakan GRCh38 FASTA
    • Buat reference index dengan minimap2
    • Selaraskan read dengan map-ont
    • Buat BAM index dan flagstat dengan samtools, lalu periksa coverage dengan mosdepth
  • Variant calling menggunakan Clair3 dan model ONT
    • Output harus mencakup VCF
    • Jangan menafsirkan varian dengan coverage rendah secara berlebihan
    • Eksekusi MinION pertama diperlakukan sebagai validasi teknis, bukan interpretasi tingkat medis
  • Annotation dilakukan dengan memasang VEP dan memberi anotasi VCF berdasarkan GRCh38
    • Tambahkan ClinVar, gnomAD, PharmGKB
    • Tabel akhir mencakup chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth, variant quality

Referensi

Bacaan terkait

1 komentar

 
GN⁺ 4 jam lalu
Opini Hacker News

  • Saya tidak ingin melakukan sequencing sendiri di rumah, tetapi tertarik mencobanya lewat layanan pihak ketiga yang memberikan seluruh data mentah
    Saya konsumen umum yang tinggal di Eropa, dan ingin tahu rekomendasi layanan apa yang sebaiknya dipakai. Akan jadi nilai tambah besar jika penyedia tidak menyimpan data, tetapi saya tidak tahu apakah realistis menuntut sejauh itu

    • Karena basis data pihak ketiga pada akhirnya bisa bocor, saat itu jangan lupa juga untuk mengganti DNA
      Lihat kasus kebocoran 23andMe: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
    • YSEQ pada dasarnya lebih mirip bisnis kecil yang dikelola keluarga. Dua ilmuwan Jerman yang dulu membantu membangun laboratorium Texas milik Family Tree DNA kembali ke Jerman dan mendirikan pesaing kecil di bidang sequencing Y-DNA resolusi tinggi untuk genealog
      Jika diminta, mereka juga melakukan whole-genome sequencing beresolusi tinggi. Namun prosesnya lama, dan mereka menyatakan berhak membatalkan pesanan jika pelanggan mengeluh soal keterlambatan. Ini bukan pilihan termurah, tetapi dari sudut pandang privasi orang Eropa, menurut saya cukup baik. Semakin penting privasi, penyedia yang agak “sulit diajak berurusan” justru bisa lebih baik
    • Dulu saya kebetulan bertemu seorang peneliti kanker yang sedang datang ke kota untuk konferensi, lalu menanyakan hal yang sama. Ia menyarankan menghubungi langsung orang yang tercantum di situs web laboratorium lokal dan bertanya apakah mereka bisa membantu, atau ke mana sebaiknya pergi
      Ia bilang pernah melakukannya sendiri di beberapa negara, tetapi saya masih tidak tahu apakah orang-orang membantunya karena jabatannya. Meski begitu, ia yakin bahkan seorang software engineer biasa pun bisa menemukan orang yang bersedia membantu. Jika ada laboratorium di dekat Anda, patut dicoba
    • Saya memakai myheritage, lalu mengekspor semua data, serta meminta penutupan akun dan penghapusan data
      Alasan utama saya memilihnya adalah karena saat itu ada produk murah seharga 30 euro
    • Saya membutuhkan data mentah long-read. Saya konsumen umum yang tinggal di Eropa, khususnya Jerman, dan ingin tahu apakah ada layanan pihak ketiga yang menyediakannya serta berapa biayanya
      Alasan saya membutuhkan long-read adalah karena informasi yang saya inginkan berada pada gen-gen duplikat yang hampir identik. Saya punya file FASTQ dan BAM dari Dante Labs, tetapi belum berhasil mengekstrak informasi yang saya cari dari sana

  • Saya tidak mengerti bagian yang mengatakan, “Ini dokumen yang dibuat agar dibaca AI, jadi salin URL-nya ke ChatGPT dan tempel untuk mendapat panduan. Kalau punya kacamata AR, lebih bagus lagi karena AI bisa memandu seluruh protokol.” Kedengarannya seperti sihir

    • Dari sudut pandang penulis, maksudnya adalah panduan prosedur hands-free. Dengan mengunggahnya ke ChatGPT atau Claude lalu mengikutinya sambil berdialog, menjalankan prosedur jadi lebih mudah daripada harus bolak-balik ke layar komputer untuk mengecek, dan perpindahan konteks juga berkurang
      Bisa saja dibaca sendiri, tetapi isinya cukup padat
    • Sepertinya tujuannya adalah menyediakan catatan yang spesifik tetapi ringkas, lalu membiarkan model bahasa besar mengisi penjelasan yang kurang menjadi panduan langkah demi langkah
    • Terasa seperti pendekatan yang cukup cerdas. Banyak orang akan meminta GPT memahami teks lalu merangkum atau mengambil bagian yang diperlukan, alih-alih membaca langsung tulisan blognya. Jadi penulis membuat materinya agar optimal untuk hasil dari tahap pascaproses yang umum itu

  • Saya pernah memikirkan perusahaan yang mengambil akar dari pipa pembuangan, lalu jika perlu mengidentifikasi tanaman apa itu lewat sequencing, dan memberi tahu apa yang harus dibunuh sebelum pipa runtuh
    Jika bisa menunda penggantian pipa pembuangan senilai 10 ribu dolar selama beberapa tahun, saya rasa banyak orang mau membayar 100 dolar

    • https://www.envirodna.com/

      https://www.naturemetrics.com/species-detection

      https://www.ednacollab.org/industry/

      https://wilderlab.co/

      Perusahaan-perusahaan seperti ini berfokus pada DNA lingkungan. Sebagian lebih dekat ke pemantauan oleh pemerintah daerah, sebagian juga menyasar pelanggan perorangan

    • Saya kurang paham mengapa ini diperlukan. Seberapa jauh lebih baik cara membunuh tanaman tertentu dibandingkan metode yang menargetkan semua tanaman yang mungkin ada? Bisa saja mengombinasikan beberapa jenis perlakuan herbisida, dan saya menduga opsi seperti itu lebih murah daripada biaya layanan ini

    • Ini ide yang benar-benar cerdas, dan dalam kondisi yang tepat saya pasti akan membayar
      Namun setelah dipikir-pikir, bukankah menuangkan sesuatu seperti herbisida spektrum luas yang biodegradable ke saluran pembuangan bisa memberikan efek yang sama dengan biaya lebih murah?

    • Saya penasaran bagaimana pendekatannya agar cukup banyak orang mengetahui layanan ini dan memesannya. Di sini saya jadi memikirkan peluang bisnis minimum yang layak dijalankan

    • Sulit juga membuat tukang pipa mengetuk pintu rumah dengan biaya di bawah 100 dolar. Saya penasaran apakah maksudnya 500 dolar, atau 100 dolar hanya untuk bagian analisis laboratoriumnya

  • Saya berharap ada pembahasan tentang hasilnya. Laporan-laporan sebelumnya mengenai sensor dan proses ini mendapat penilaian yang cukup beragam
    Prosesnya sendiri keren, tetapi saya ingin tahu seberapa berguna hasil yang keluar dari lingkungan nyata

  • https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/

    Untuk cara yang cepat dan relatif murah, ada opsi seharga 599 dolar

    • Kalau laboratoriumnya berbasis di AS, bukankah mereka tunduk pada CLIA dan persyaratan penyimpanannya?
      Dengan biaya 7.500 dolar atau lebih, Anda bisa mendapatkan privasi yang terjamin. Atribut lainnya bisa berbeda seperti yang disebut di komentar-komentar, tetapi setidaknya datanya tidak keluar dari rumah
    • Layanan dan peralatan bukan hal yang sama

  • Ingin melakukan sequencing, tetapi tidak ingin perusahaan, pemerintah, atau organisasi agama mana pun mengakses data saya
    Ketika penulis mengatakan “kalau punya VCF, bisa dijalankan lewat alat seperti VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude”, bukankah data saya justru masuk ke tangan pihak-pihak yang ingin saya hindari?

    • Untuk VEP, ClinVar, gnomAD, tidak demikian. Mereka adalah alat open source atau basis data yang bisa dipakai secara offline. Tidak ada yang bisa tahu apakah Anda mengunduh atau melakukan kueri
      Sebaliknya, Claude memang berarti menyerahkan data. Namun tahap itu tidak wajib. Jika menjalankan pipeline standar, Anda akan mendapatkan file VCF yang berisi variasi genom, dan bisa memberi anotasi pada tiap variasi. Dengan memeriksa gen yang sudah diberi anotasi, Anda dapat menilai apakah suatu variasi bersifat patogenik, kemungkinan patogenik, berpatogenisitas rendah, atau jinak

  • Benar-benar menakjubkan bahwa benda sebesar telapak tangan bisa melakukan hal seperti ini. Kalau sampai muncul perangkat CRISPR berukuran serupa, sepertinya kita harus berhenti di sini karena ini mulai menjadi alur cerita Gattaca

  • Saya punya pengalaman mengambil DNA dan melakukan sequencing di wet lab, meski hampir 20 tahun lalu, dan pekerjaan ini sulit serta sering gagal. Terutama jika tidak ada lingkungan yang sangat bersih, tingkat kegagalannya akan jauh lebih tinggi
    Setelah datanya ada pun, Anda perlu bertanya pada diri sendiri seberapa akurat data itu mengingat kondisi pengumpulannya, dan juga memeriksa kesalahan sequencing yang berkorelasi yang mungkin tidak diperhitungkan. Selain itu, konseling genetik adalah bidang profesional yang benar-benar dipelajari orang. Sebelum bertanya kepada model bahasa besar apa arti data genetik bagi diri Anda, Anda perlu punya akses ke seseorang yang bisa memberi konteks pada data tersebut dan menghubungkan Anda dengan pakar terkait. Bahkan dengan gelar PhD di bidang ini pun, saya tidak yakin bisa menafsirkan data saya sendiri secara dingin dan rasional
    Sebagai tambahan, saya tidak tahu mengapa tautan Molecular Biology of the Cell mengarah ke edisi ke-6, bukan edisi ke-7 yang terbit 4 tahun lalu. Tiga edisi pertama adalah buku yang salah satu penulisnya pembimbing saya pada program PhD pertama, dan dialah orang yang menunjukkan bahwa gagasan Roger Penrose bahwa mikrotubulus penting dalam kemotaksis E. coli adalah omong kosong total. Orang yang hebat. Pada 2007 saya pernah menganalisis data Illumina yang secara komersial masih sangat awal, dan karena bisa disejajarkan ke genom referensi, bias tertentu dapat diidentifikasi. Teknologi nanopore kemungkinan memiliki bias seperti itu lebih banyak, dan jika Anda tidak mampu memperhitungkannya, Anda bisa menghadapi masalah besar

    • Data nanopore jauh lebih mudah dianalisis daripada data sequencing short-read. Karena read yang dihasilkan sangat panjang, ia tidak mengalami masalah alignment dan assembly yang sama
      Itu juga pandangan saya sebagai pemegang gelar master biokimia
    • Teknologi sequencing Oxford Nanopore cukup andal untuk digunakan. Memang harus membeli kit, tetapi ini sangat bisa dilakukan, dan sama sekali tidak sebanding dengan menuang gel sendiri atau melakukan reaksi Sanger berlabel radioaktif
      Alih-alih memakai perusahaan genomik pribadi, Anda juga bisa menyerahkannya ke perusahaan yang menyediakan jasa outsourcing sequencing untuk laboratorium. Soal risiko interpretasi, saya sepenuhnya setuju

  • Saya suka bagian yang sadar privasi. Selain masalah yang jelas dari “menjalankannya lewat Claude”, saya penasaran berapa banyak alat analisis yang disebutkan itu sepenuhnya open source, atau setidaknya bisa dijalankan secara lokal
    Akan bagus kalau tulisan itu membahas bagian tersebut

    • Dari hasil melihat sekilas, tampaknya semuanya membuka kode sumbernya dan juga bisa dijalankan secara lokal

  • Bagaimana saya tahu apakah hasil yang saya terima itu benar-benar asli, atau cuma sampah?